关节炎中行使非重叠效应子功能的两类成纤维细胞

对于单细胞测序而言，由于其技术和研究角度的特殊性，文章结构和常规测序类文章相比还是有比较大的差别。单细胞类文章主要分为两种思路：图谱类文章和图谱基础上选定特定细胞类型，增加功能验证。图谱类文章主要是以测序结果描述为主，主要用于构建特定组织、器官、疾病类型的细胞图谱或特定组织不同发育阶段的细胞图谱，比较依赖于数据分析。而后者需要在细胞图谱基础上结合多种功能和表型验证试验，整体试验会比较复杂。本篇文章是一篇典型的单细胞测序+功能验证文章，涵盖了单细胞转录组测序、微量转录组测序、流式分选、质谱流式、免疫组化等技术，值得参考。

题目：关节炎中行使非重叠效应子功能的两类成纤维细胞

单位：牛津大学、伯明翰大学医学与牙科科学学院、美国哥伦比亚大学

发表时间：2019.5

期刊：Nature

IF: 43.07

技术手段：10X单细胞转录组测序、微量转录组测序、流式分选、质谱流式、免疫组化

摘要鉴定具有非重叠效应子功能（non-overlapping effector functions）的淋巴细胞亚群对于免疫介导的炎性疾病（IMID）靶向治疗的发展至关重要，然而目前尚不清楚发生炎症的关节中是否存在具有不重叠功能、并且是IMID中多种组织驱动过程的诱因（例如炎症和损伤）的成纤维细胞亚类。本文确定并描述了参与介导关节炎炎症和组织损伤的不同成纤维细胞亚群的生物学特性，在缓解和持久性关节炎小鼠模型中，表达成纤维细胞活化蛋白-α（FAPα）的成纤维细胞的消耗可以抑制炎症和骨侵蚀。单细胞转录组分析确定了FAPα⁺细胞存在两个不同的成纤维细胞亚群：位于滑膜亚层的FAPα⁺THY1⁺免疫效应成纤维细胞，以及局限于滑膜衬里的FAPα⁺ THY1⁻破坏型成纤维细胞。当过继转移到关节中后，FAPα⁺ THY1^-成纤维细胞选择性地介导骨骼和软骨损伤，对炎症的影响很小，而FAPα⁺  THY1⁺ 成纤维细胞的过继转移导致严重和持续性的炎性关节炎，但对骨骼和软骨的影响很小。本文描述了解剖学上离散、功能不同的成纤维细胞亚群，对旨在调节炎症和组织损伤的细胞疗法具有重要指导意义。
文章结果非造血性的、组织驻留的成纤维细胞是许多疾病的发病机理，类风湿关节炎（RA）是一种典型的IMID，类风湿关节炎中滑膜成纤维细胞会同时导致关节损伤和炎症。从符合RA分类标准的患者中分离出的滑膜组织，以及分离自RA患者培养后的滑膜成纤维细胞，它们的FAPα（一种细胞膜二肽基肽酶）表达与关节炎症得以缓解（Resolving）的患者以及健康对照相比明显更高，这表明表达FAPα的成纤维细胞可能与类风性关节炎相关联（上图）。
为了分析FAPα⁺ 细胞在RA滑膜中的分布，采用质谱流式和共聚焦显微分析发现FAPα在滑膜亚内层（sub-lining layer，SL，PDPN⁺  THY1⁺ ）和内层（lining layer， LL，PDPN⁺  THY1^-）成纤维细胞中均表达（上图d），同时也发现一小部分周细胞也表达FAPα。
使用FAPα luciferase-DTR 报告小鼠构建血清转移性关节炎（STIA）模型，发现FAPα在炎症发生过程中表达增加（上图f，g），并且主要在滑膜和软骨和骨骼血管翳组织侵犯区域高表达（上图i），并与踝关节肿胀的严重程度正相关（上图h）， FAPα⁺ 成纤维细胞在炎症期间数量增多（上图j，k），炎症消退后恢复到正常数量，表明FAPα是组织炎症的生物标志物。
炎症诱导后，PDPN, FAP和 THY1表达升高（上图i），并与关节肿胀程度呈正相关（上图m），同时发现与周细胞相比，THY1⁻FAPα⁺ (LL) 和THY1⁺FAPα⁺ (SL)细胞数量增加（上图n），表明潜在的滑膜成纤维细胞致病性群体扩张以PDPN，FAPα和THY1的表达为标志。、为了确定FAPα⁺成纤维细胞在体内的功能，研究人员在关节炎模型中选择性消耗FAPα⁺成纤维细胞，发现这些细胞的缺失导致：滑膜的细胞结构降低；滑膜炎症减弱（上图a、b）；关节结构损伤(软骨和骨损伤)、炎症性骨重塑、血管翳形成降低（上图c、d）;破骨细胞数量（上图d）和对应基因表达降低；白细胞浸润程度降低（上图e）；FAPα⁺细胞数量与关节炎症严重程度负相关（上图f）；LL和SL成纤维细胞数量减少（上图g）；周细胞数无明显变化、中性粒细胞，巨噬细胞、CD11b⁺树突状细胞和单核细胞数量减少，嗜酸性粒细胞数量不变；促炎性趋化因子，细胞因子，RANKL和基质金属蛋白酶（MMP）显着减少，表明滑膜FAPα⁺细胞是这些蛋白的主要来源（上图h、i）。为了调查了THY1-FAPα⁺（LL）和THY1⁺FAPα⁺（SL）成纤维细胞群体是否对炎症和骨骼损伤均起同样作用，研究人员首先对发炎的小鼠滑膜中CD45-非造血细胞进行了单细胞RNA测序（上图a），对成纤维细胞进行了重新聚类，获得了5个成纤维细胞亚群（F1-F5）（上图b）：F1表达与骨骼，软骨和细胞外基质形成相关的基因；F2表达炎症基因，包括参与“细胞因子产生”和“白细胞趋化性调节”的基因；F3表达“补体激活”和“血管生成”生物过程有关的基因；F4表达细胞周期基因；F5表达“酸分泌”和“氢转运”相关的基因（上图c）。
基因特异性表达分析发现，PDPN和FAP则由所有成纤维细胞亚群表达，而Thy1由F1-F4选择性表达，而非F5，表明F1-F4来自SL而F5来自LL（上图d）。同时拟时序分析发现成纤维细胞存在F1–F2–F3–F4 和 F1–F2–F5两种发展关系（上图e）。而对取自RA患者滑膜的活检样本进行单细胞测序，共得到5个成纤维细胞clusters，直系同源基因分析发现人-鼠间存在3个同源聚类（上图f，g）。为了确认PDPN, THY1、FAPα作为区分LL成纤维细胞和SL成纤维细胞表面标记物的有效性，作者分离纯化了PDPN⁺、FAPα⁺/⁻和 THY1⁺/⁻细胞开展了微量转录组测序（上图a），获得的四组数据（ PDPN⁺FAPα⁺THY1⁺、PDPN⁺FAPα⁺THY1⁻ 、PDPN⁺FAPα⁻THY1⁺ 、PDPN⁺FAPα⁻THY1⁻ ）依照THY表达分为两个组分（上图b），THY1⁺细胞表达趋化因子和细胞因子基因（F1-F4相关基因），THY1⁻细胞表达F5相关基因（上图c）。蛋白表达分析验证了单细胞测序结果，即FAPα⁺ THY1⁺成纤维细胞高表达趋化因子和细胞因子相关基因（Il6、Lif、Il33、Il34），而FAPα⁺ THY1^-成纤维细胞表达破骨细胞可能的诱导子（Ccl9 、Tnfsf11）以及参与软骨退化相关基因（Mmp3、Mmp9 、Mmp13）（上图a），另外FAPα⁺ THY1⁻ 细胞中RANKL（RANK受体激活物配体，RANKL能结合表达RANKL受体的破骨细胞前体，被认为是调控破骨细胞生成的关键细胞因子之一）表达升高，RANKL：OPG比升高（上图b），FAPα⁺ THY1⁻ 细胞能够体外刺激破骨细胞分化和活化，使羟基磷灰石基质吸收能力增强（上图c）。
分别将PDPN⁺FAPα⁺THY1^-或PDPN⁺FAPα⁺THY1⁺细胞注射到小鼠发炎踝关节，发现注射PDPN⁺FAPα⁺THY1⁺细胞会导致关节肿胀程度更加严重（上图e），且持续时间更长，白细胞浸润水平更高（上图f），但对骨骼和软骨破坏影响不大（上图g）；而注射PDPN⁺FAPα⁺THY1⁻细胞对关节炎症，炎症动力学和白细胞浸润没影响，但增强了骨骼和软骨破坏（上图g）。
临床扩大样本分析，发现RA患者（表现持续炎症）滑膜中PDPN⁺FAPα⁺THY1⁺细胞比例更高，OA患者（表现软骨损伤）PDPN⁺FAPα⁺THY1^-比例更高（上图i），并且PDPN⁺FAPα⁺THY1 ⁺细胞比例与全身/组织炎症指标正相关（上图j）。以上数据表明，PDPN⁺FAPα⁺THY1⁺细胞通过产生不同的趋化因子和细胞因子维持炎症，PDPN⁺FAPα⁺THY1^-细胞作为骨效应细胞调解关节损伤。相关阅读干货:做了几万次单细胞实验吐血得出10X文库PCR循环数的影响因素 | 单细胞专题
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